Isolasi DNA Plasmid dari Sel Inang E. coli yang Terinsert Enzim Xilanase

LAPORAN

PRAKTIKUM BIOKIMIA LANJUT

“Isolasi DNA Plasmid dari Sel Inang E. coli yang Terinsert Enzim Xilanase”

Oleh

·      MAT SALEH                         (091524153001)

                    ·      MOCH SAAD                       (091524153004)                     

·      FAHMI HASBI A.                (091524153005)

·      DEWI NURMALITA S.       (091524153007)

·      ASTI PERMATA N.             (091614153001)

S2-BIOTEKNOLOGI PERIKANAN DAN KELAUTAN

FAKULTAS PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS AIRLANGGA

SURABAYA

2017

BAB I

PENDAHULUAN

1.1.        Latar Belakang

Deoxyribonucleic Acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetika makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya (Suryo, 2004). Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nukleus yang disebut sebagai DNA kromosomal. Selain DNA kromosomal, terdapat DNA ekstrakromosomal diantaranya plasmid, mitokondria dan kloroplas. Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal yang berbeda karakternya dengan DNA kromosomal. Bentuk plasmid adalah sirkuler double helix dengan ukuran 1 kb sampai lebih dari 200 kb. Pada bakteri jumlah plasmid yang dimiliki bervariasi bahkan sampai ribuan ataupun tidak memiliki plasmid. 

Kromosom adalah suatu struktur makromolekul yang berisi DNA di mana informasi genetika dalam sel disimpan, sekuens DNA yang terletak pada kromosom disebut DNA. Kromosom terdiri dari DNA, RNA (asam ribo nukleat) dan protein (Desrizal, 2012).

Plasmid adalah molekul DNA sirkular berukuran kecil yang terpisah dari kromsom. Palsmid ini ditemukan di dlam bakteri dan ragi yang merupakan eukariota uniseluler. Plasmid dapat bereplikasi tanpa tergantung dengan genom sel yang lain dan kadang-kadang ditransfer diantara sel-sel (Campbell 2002). Beberapa karakteristik dari plasmid yang patut diketahui antara lain: dapat ditransfer ke bakteri lain dan memiliki ORI (Origin of replication) sehingga mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA kromosom. Plasmid merupakan potongan melingkar DNA yang ukuranya kecil (kurang lebih 2000 sampai 10000 pasangan basa) yang berisi informasi genetik yang penting untuk pertumbuhan bakteri.  Plasmid bekteri yang biasanya merupakan molekul DNA untai ganda dengan ukuran dari 1 kb sampai dengan lebih dari 200 kb. Plasmid ini terdapat dalam berbagai spesies bakteri dan merupakan satuan genetik tambahan yang bereplikasi dengan tidak tergantung pada kromosom bakteri dan diturunkan kepada anakan. Akan tetapi, dalam replikasi dan transkripsi tetap tergantung pada enzim yang terdapat pada sel inang. Biasanya, plasmid membawa gen yang menjadi enzim yang pada keadaan tertentu menguntungkan sel inang, di antaranya resisten terhadap antibiotik, produksi antibiotik, degradasi senyawa organic kompleks, produksi kolkisin, produksi enterotoksin, enzim restriksi, dan enzim modifikasi (Sudjadi, 2008).

DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol (Wane, 2011).

Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada dibagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunujukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah, (Campbell dkk., 2002). Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Dolphin, 2008). Sehingga dalam praktikum ini diharapkan praktikan mampu melakukan isolasi DNA kromosomal bakteri dan isolasi DNA plasmid dengan metode spin column.Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006). Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Alberts., 1994).

Sebagai penyusun genetic yang dapat replikasi sendiri, plasmid dapat merupakan vector yang membawa DNA yang diklon. Akan tetapi, plasmid alam tidak mempunyai sifat-sifat yang diperlukan sebagai vector cloning yang baik. Sifat yang diperlukan sebagai vektor kloning adalah: Berukuran kecil, sehingga mudah diisolasi dan menaikkan efisiensi transformasi ke dalam E. Coli. Efisiensi transformasi ini menurun sesuai dengan kenaikan ukuran plasmid; Mempunyai lokus tunggal restriksi endonuklease tertentu untuk penyisipan DNA yang diklom; dan Mempunyai satu atau lebih penanda genetik seleksi sebagai identifikasi sel yang telah membawa plasmid rekombinan. Semua plasmid kloning telah mengalami rekayasa genetik (Sudjadi, 2008).

Elektroforesis merupakan teknik pemisahan suatu molekul dalam suatu campuran di bawah pengaruh medan listrik. Molekul terlarut dalam medan listrik bergerak atau migrasi dengan kecepatan yang ditentukan aleh rasio muatan dan massa. Sebagai contoh, jika dua molekul mempunyai massa dan bentuk yang sama, molekul dengan muatan lebih besar akan bergerak lebih cepat ke elektroda. Elektroforesis melalui gel agarose atau poliakrilamid merupakan metode standar untuk pemisahan, identifikasi, dan pemurnian fragmen DNA (Sudjadi, 2008).

Prinsip praktikum kali ini adalah merujuk pada praktikum sebelumnya, pelet sel bakteri diresuspensi dan dilisis menggunakan SDS/basa (Sodium Dodesil sulfat) untuk melepaskan DNA plasmid. Lisat dinetralisasi untuk menghasilkan kondisi pengikatan DNA plasmid ke membrane silica pada kolom spin. Debris sel dan SDS diendapkan melalui sentrifugasi, lalu supernatant yang mengandung DNA plasmid dituang ke dalam membrane pada kolom spin. DNA yang teradsorpsi dicuci untuk menghilangkan kontaminan, lalu DNA tersebut dielusi menggunakan Elution Buffer.

1.2.       Tujuan

Tujuan dilakukannya praktikum “Isolasi DNA Plasmid dari Sel Inang E. coli yang Terinsert Enzim Xilanase”  adalah sebagai berikut :

1.      Mengetahui cara melakukan isolasi plasmid DNA pada bakteri E. coli

2.      Mengetahui cara deteksi DNA melalui elektroforesis.

1.3.       Manfaat

Manfaat dilakukannya praktikum “Isolasi DNA Plasmid dari Sel Inang E. coli yang Terinsert Enzim Xilanase”  adalah sebagai berikut :

1.      Mahasiswa dapat mengetahui teknik dalam melakukan isolasi plasmid DNA pada bakteri E. coli.

1.4.       Waktu dan Tempat

Praktikum DNA dilaksanakan pada Kamis, 01 Desember 2016 dan Rabu, 07 Desember 2016 di Laboratorium Proteomik ITD, Universitas Airlangga, Surabaya – Jawa Timur.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1.            Plasmid

            Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Plasmid adalah unsur genetik di luar kromosom (ekstrakromosoma) yang mengadakan replikasi secara autonom di dalam sel bakteri. DNA-nya berbentuk lingkaran dan beruntai ganda. Dan plasmida itu mendukung gen yang diperlukan baik untuk replikasi plasmida maupun untuk fungsi lain. Umumnya wahana plasmida mempunya densitas apungan berlainan daripada DNA inang dan dengan mudah dapat dimurnikan. Beberapa plasmida memiliki beberapa kemampuan untuk berintegrasi ke dalam kromosom inang, dan plasmida ini disebut episom (Widyastuti, 2006).

            Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006).

2.2.            DNA

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme (Jamilah, 2005). DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999).

Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nukleus yang disebut sebagai DNA kromosomal. Selain DNA kromosomal, terdapat DNA ekstrakromosomal diantaranya plasmid, mitokondria dan kloroplas. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA dapat diisolasi, baik dari sel hewan, manusia, maupun pada tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas plasma darah, globulus lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan hormon), dan gas (oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah terdiri atas eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet). Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, dimana terdapat DNA di dalamnya. DNA pada tumbuhan juga dapat diisolasi, contohnya pada tumbuhan bawang merah (Allium cepa) dan pada pisang (Musa sp.).

2.3.            Isolasi DNA Plasmid

Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu: (1)Isolasi sel; (2)Lisis dinding dan membran sel; (3)Ekstraksi dalam larutan; (4)Purifikasi; dan (5)Presipitasi. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm. Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip-prinsip isolasi DNA plasmid hampir sama dengan isolasi total DNA/RNA dari jaringan. Langkah pertama untuk mendapatkan DNA plasmid adalah dengan menumbuhkan sel-sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan. Setelah itu sel dipanen, dinding serta membran sel dipecah sehingga isi sel (ekstrak sel) keluar. Ekstrak sel ini kemudian dipurifikasi dengan serangkaian perlakuan sehingga diperoleh DNA plasmid yang murni. Isolasi DNA yang dilakukan dalam penelitian ini menurut standar prosedur yang sudah biasa dilaksanakan. Homogenisasi sel dengan prosedur ini akan menghasilkan DNA utuh karena proses ini menyebabkan disrupsi sel dan tercucinya komponen-komponen sel lain selain DNA. Penambahan kloroform setelah sentrifugasi memisahkan larutan menjadi fase cair dan padat dimana fase cair merupakan DNA dan fase padat adalah campuran protein dan DNA.

Isolasi plasmid dari bakteri E.coli biasanya disebut dengan istilah Miniprep, kependekan dari Mini-Preparation. Sesuai dengan istilahnya, pekerjaan ini tidak banyak memakan waktu dan tidak pula berat untuk dilakukan. Bakteri E. Coli yang digunakan dalam transformasi gen atau lebih dikenal dengan istilah kloning gen, pada awalnya hanya mempunyai satu macam untaian DNA atau kromosom (kromosom genomik atau kromosom utama). Setelah ditransformasi dengan DNA plasmid rekombinan , maka bakteri tersebut mempunyai dua macam DNA yaitu kromosm genomik dan ekstra kromosom (DNA plasmid) yang mempunyai karakter yang berbeda. Untuk dapat mengisolasi kedua macam DNA tersebut digunakan metode yang berbeda. Dalam praktikum akan diisolasi DNA plasmid dengan mengunakan metode mini prep yaitu metode isolasi plasmid pada skala kecil. DNA rekombinan dibuat dengan cara sebagai berikut : Sepotong DNA dari organisme yang diminati, disambungkan ke dalam atau ke suatu plasmida ataupun pemakan bakteri lamda (disebut wahana atau vektor) dan molekul kimerik yang dihasilkan, masing-masing berturut-turut digunakan untuk mentransformasikan atau menginjeksi sel bakteri inang. Bakteri inang biasanya merupakan suatu galur khas E.coli yang tidak mampu memperbanyak diri tanpa kondisi biakan yang khusus.

Agar sepotong DNA dapat diklonkan untuk penelitian, lebih dahulu DNA itu harus diikat pada suatu wahana kloning atau vektor. Salah satu tipe wahana kloning yang digunakan untuk percobaan ini adalah plasmid. DNA disambungkan pada DNA plasmid dan molekul kimeriknya digunakan untuk mengubah bentuk bakteri inang seperti E. Coli. Kemudian plasmid mengadakan replikasi dalam inang, sewaktu inang tumbuh dan membelah, dan potongan DNA yang diinginkan terklonkan.

Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah :

a.    plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi;

b.    DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia;

c.    mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi;

d.    jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi;

e.     mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu. (Brock, et al., 1994).

Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader 193). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002).

BAB III

METODOLOGI

3.1.      Materi

Alat dan Bahan

            Alat dan bahan adalah segala sesuatu yang mendukung terlaksanakannya praktikum DNA sehingga kegiatan membuktikan kandungan DNA dan Isolasi Plasmid dapat berjalan dengan baik. Peralatan pendukung yang digunakan dalam pelaksanaan praktikum ini yaitu tabung reaksi sebagai wadah pereaksi, timbangan digital untuk menimbang  bahan raegen, serta alat pendukung lainnya. Alat yang digunakan dalam praktikum DNA secara terperinci disajikan pada Lampiran 1.

            Bahan yang digunakan dalam pelaksanaan praktikum ini antara lain plasmid E. coli sebagai dna yang akan diisolasi, EDTA berfungsi untuk mengikat ion. Bahan yang digunakan dalam praktikum secara terperinci disajikan pada Lampiran 2.

3.1.1.      Elektroforesis Gel Agarosa

Bahan :

1.                    Agarosa                                                                                  0,4 gram

2.                    Bufer TAE (tris-asetat 40 mM & Na₂EDTA 1 mM pH8)     100 mL

3.                    Etidium Bromid (EtBr)                                                          250 µg/Ml

4.                    Loading buffer                                                                        1 µL

5.                    Sampel                                                                                    5 µL

6.                    Marker                                                                                    6 µL

7.                    Aquades

8.                    Alkohol

Alat      :

1.                    Elektroforesis

2.                    Timbangan digital

3.                    Hot plate

4.                    Cetakan gel agarosa

5.                    Micropipet

6.                    Isolasi coklat

7.                    Sinar UV

3.1.2.  

                        Media isolasi DNA :

Bahan :

1.      NaCl                0,5 gram

2.      Tryptone          0,5 gram

3.      Yeast Extract  0,5 gram

Alat :

1.      Timbangan digital

2.      Erlemenyer

3.      Tabung reaksi

4.      Aluminiumfoil

5.      Kasa

6.      Autoclave

7.      Spatula

3.1.3.      Isolasi Plasmid E. coli

Bahan :

1.                  Larutan I (10 ml)

a.                   50 Mm Glukosa                                              1 ml

b.                  25 Mm tris HCL (ph 8)                                   2,5 ml

c.                   10 Mm EDTA (ph 8)                                      0,25 ml

2.                  Larutan II (FRESH)

a.                   0,2 M NaOH                                                   200 µL

b.                  SDS 1%                                                           100 µL

c.                   H₂O                                                                 700 µL

3.                  Larutan III

a.                   5 M Na-asetat                                                 4,1 gram

b.                  H₂0                                                                  2,85 ml

c.                   As. Asetat glacial                                            1,15 ml

4.                  Ethanol absolut

5.                  Ethanol 70%

6.                  Distiled water

7.                  Fenol : Kloroform : isoamil                                        (2,5 :2,4 : 0,1) ml

8.                  Es batu

Alat :

1.                  Timbangan digital

2.                  Spatula

3.                  Micropipet

4.                  Sterefoam tempat es batu

3.2.      Metode

3.2.1.   Elektroforesis Gel Agarosa

            Berikut merupakan langkah kerja yang dilakukan :

1.                  Gel agarosa 1% dibuat dengan melarutkan 0,4 gram agarosa dalam 40 mL bufer TAE dengan memanaskan menggunakan hotplate ±20 menit, hingga agarosa terlarut.

2.                  Kemudian didinginkan atau dibiarkan sampai kira-kira temperatur 45^oC.

3.                  Selanjutnya gel agarosa tadi dituangkan pada cetakan dan dibiarkan memadat (Jangan sampai miring, letakan pada bidang datar).

4.                  Setelah memadat , potong gel agarosa sesuai dengan kebutuhan.

5.                  Meletakkan gel agarosa yang dipotong pada alat elektroforesis dan tuangkan bufer TAE ke dalam elektroforesis hingga gel agarosa terendam.

6.                  Sampel yang akan dielektroforesis dicampur dengan loading buffer masing-masing diambil menggunakan micropipet, kemudian di resuspensi diatas solasi coklat.

7.                  Sampel diambil menggunakan micropipet dan kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa.

8.                  Elektroforesis dilakukan dalam tegangan 80-100 volt selama ± 30 menit, hingga bromophenol blue telah bermigrasi kira-kira 2/3 dari panjang gel.

9.                  Kemudian gel agarosa direndam dalam Etidium Bromida (Et-Br) 250 µg/Ml selama 15 menit.

10.              Setelah itu sisa Et-Br dihilangkan menggunakan aquades.

11.              Pita-pita DNA dapat diamati dengan sinar UV.

12.              Sebelum diamati menggunakan sinar UV, bidang sinar UV yang digunakan untuk meletakkan sel agarosa disemprot dengan alkohol dan di bersihkan menggunakan tissue.

3.2.2.   Media isolasi DNA :

            Berikut merupakan langkah kerja yang dilakukan :

1.                  Menimbang semua reagen menggunakan timbangan digital.

2.                  Masukan semua reagen ke dalam erlemenyer, tambahkan 50 ml aquades dan larutkan.

3.                  Kemudian dibagi ke dalam 10 tabung reaksi, masing-masing 5 ml (tutup tabung menggunakan kasa dan dilapisi aluminiumfoil).

4.                  Selanjutnya di autoclave selama 2 jam, kemudian isolat bakteri ditumbuhkan ke dalam media TCBS.

3.2.3.   Isolasi Plasmid E. coli

 Berikut merupakan langkah kerja yang dilakukan :

1.                 1. Menimbang dan menghitung reagen-reagen, menggunakan rumus pengenceran dan kemolaran.

Rumus pengenceran    : V₁.N₁ = V₂.N₂

Rumus kemolaran       : M = gr/mr . 1000/vol

2.        2. Setelah itu sebanyak 1 ml suspensi sel bakteri yang sudah ditumbuhkan selama 16-18 jam dipanen dan disentrifugasi pada 7.500 rpm selama 5 menit pengulangan sebanyak 5 kali. (Setiap berhenti 5 menit, supernatan yang awal dibuang dan di sisa pellet dibiarkan kemudian ditambahkan kembali 1 ml suspensi sel bakteri).

3.         3. Setelah sebanyak 5 kali pengulangan supernatan dibuang, pellet sel diresuspensi dengan 100 µL dengan larutan I menggunakan micropipet.

4.        4. Kemudian dicampur dan didiamkan selama 5 menit.

5.       5.  Menambahkan 200 µL larutan II, dan dihomogenkan dengan membolak balik tabung kemudian diinkubasi di dalam box strefoam es selama 15 menit.

6.        6. Tambahkan 150 µL larutan III, homogenkan kemudian inkubasi di es selama 10 menit.

7.       7. Setrifugasi campuran pada 7.500 rpm selama 5 menit pada suhu 4^oC.

8.        8.  Supernatan diambil dan dipindahkan ke dalam tabung yang baru steril.

9.        9. Tambahkan fenol : kloroform : isoamil 1 x volume, divortex.

10.     10. Sentrifugasi 7.500 rpm selama 2 menit, 4^oC.

11.      11.  Supernatan dipindahkan ke tabung baru yang steril.

12.     12. Ulangi prosedure 8 dan 9.

13.     13. Fase paling atas dipindahkan ke effendorf baru.

14.     14. Tambahkan etanol absolut sebanyak 2x volume, diamkan dalam es selama 1 jam.

15.     15. Sentrifugasi 7.500 selama 5 menit.

16.     16. Supernatan dibuang, kemudian pellet dicuci dengan etanol 70% sebanyak 1x volume

17.     17. Sentrifugasi 7.500 rpm selama 5 menit, kemudian keringkan.

18.     18. Pellet dikeringkan kemudian dilarutkan dengan 30 µL distiled water.

BAB IV

PEMBAHASAN

1.1.       Elektroforesis Gel Agarosa

Hasil praktikum isolasi DNA dan elektroforesis ditunjukkan dalam foto hasil elektroforesis yang menunjukkan adanya migrasi DNA (Gambar 1). Migrasi DNA terlihat berpendar dibawah sinar UV. 

(Gambar 1. Foto Hasil Elektroforesis DNA)

       Ukuran DNA dapat diketahui dengan membandingkan DNA target dan DNA marker yang sudah diketahui berat molekul (kDa). Berdasarkan hasil pengamatan isolasi DNA, ada yang berhasil dan ada yang tidak berhasil. Hal ini dapat dilihat berdasarkan pendaran pita-pita DNA yang terbentuk pada gel agarose. Gambar 1 menunjukkan ada beberapa kelompok yang tidak berhasil yaitu pada sumur ke 1, 2, 6, dan 7 (tidak terjadi running DNA).  Sedangkan pada sumur 3 (plasmid pYHM1) 5954 bp dan sumur 5 (plasmid yang terinsertkan gen lakase) berhasil . Setiap DNA mempunyai bentuk berbeda-beda sehingga mempengaruhi kecepatan migrasi yang berbeda. Hal tersebut menyebabkan letak DNA berurutan sesuai dengan kecepatan laju migrasi. Larutan yang digunakan dalam elektroforesis adalah etidhium bromida yang berfungsi untuk membantu visualisasi, karena etidhium bromida akan memendarkan sinar UV. Gel yang disinari dengan sinar UV dari bawah, maka akan tampak citra berupa pita-pita pada gel yang merupakan molekul-molekul DNA yang bergerak sepanjang gel setelah dielektroforesis. 

1.1.       Isolasi Plasmid E. coli

       Hasil praktikum isolasi DNA  plasmid E. coli menunujukkan dalam foto tidak adanya migrasi DNA (Gambar 2). Migrasi DNA tidak terlihat berpendar dibawah sinar UV.

 (Gambar 2. Foto Hasil Elektroforesis Isolasi Plasmid E. coli)

       Hasil gambar 2 menunjukkan tidak adanya kelompok yang berhasil di running DNA. Hal ini terjadi karena beberapa kemungkinan, antara lain kemungkinan terjadinya kesalahan pada saat isolasi DNA, dimana pada saat  isolasi awal tidak berhasil mengisolasikan plasmid DNA atau human eror. Kesalahan kedua kemungkinan adanya kerusakan pada reagen yang digunakan.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1.      Kesimpulan

Berdasarkan hasil dari praktikum “Isolasi DNA Plasmid dari Sel Inang E.coli yang Terinsert Enzim Xilanase”, maka didapatkan kesimpulan yaitu: beberapa DNA berhasil diisolasi dibuktikan dengan terjadinya migrasi DNA dalam teknik elektroforesis dan terdapat pula DNA yang tidak berhasil di running. Hal ini dimungkinkan adanya reagen yang telah rusak.

5.2.      Saran

Saran yang dapat diberikan dalam praktikum “Isolasi DNA Plasmid dari Sel Inang E.coli yang Terinsert Enzim Xilanase”,adalah sebagai berikut:

1.                  Pada proses praktikum diharapkan praktikan menerapkan teknik aseptis untuk menjaga agar tidak terjadi kontaminasi pada bahan yang akan diuji; serta

2.                  Perlu dilakukan pengecekan terhadap reagen yang akan digunakan agar proses praktikum dapat berjalan lancar sesuai yang diharapkan.

Categories: Laporan Praktikum